1569年、ハプスブルク家の政治的影響からの解放を求めていたコジモに、教皇ピウス5世は授封権を行使して、皇帝には従属しない「トスカーナ大公」の称号を授与した。皇帝はトスカーナは帝国に帰属するとして、教皇の越権行為を非難し、1576年、臣従の承認とひきかえに、同じ称号をコジモ（74年に死去）の息子フランチェスコに授与した。
1560年代
世界各国史15　イタリア史

大公国は旧フィレンツェ共和国領、旧シエナ共和国領、大公を封建領主とするいくつかの領地、大公の封臣となった封建領主たちの領地、制度上は相互に独立する4種の組織が、それぞれ大公に直属し、大公によって統合される同君連合だった。1562年にコジモ1世によって、オスマン海軍に対抗するためにつくられた、サント・ステーファノ騎士団に大公国各地の有力者たちが入団することで、大公国の団結が図られた。